EPMAやEDSなどの電子顕微鏡を用いた元素分布分析は電子顕微鏡観察による微細組織像と対応した元素分布像が得られることから広範囲で応用されてきた。EPMAやEDSは高真空下で電子線照射を伴うため試料に導電性が求められ、かつ照射による損傷を防ぐため多くの試料については前処理が必要である。特に損傷を受けやすい生物系試料については高度な前処理技術が不可欠となる(1)。
走査型Ｘ線分析顕微鏡（XSAM:X-ray Scanning Analytical
Microscope）はＸ線導管（XGT:X-ray Guide
Tube）を用いて集光したＸ線を試料に照射し、試料を走査することで精細な透過Ｘ線像と蛍光Ｘ線による元素分布像を同時に得るものである。Ｘ線導管は内面が回転放物面となるよう形成されたガラス管であり、管内面でのＸ線の全反射を利用してＸ線を集光している(2-5)。図1はXSAMの概略を示している。透過Ｘ線を最下部のNaIシンチレーターで、試料から放出された蛍光Ｘ線を試料斜め上方の高純度Si検出器で検出しつつ、試料ステージをＸ−Ｙ方向に操作して観察を行う。試料室は大気雰囲気であるが、試料上方のマイラ膜を介して装置部分を真空とし大気層の厚みを約1mmとすることで、蛍光Ｘ線の減衰を低減して検出感度を保持しながら大気雰囲気での観察を可能にしている。近年実用化されたこの顕微鏡は、コーティングなどの試料の前処理が必要なく、X線照射によるため試料への損傷がきわめて少ないのが最大の特徴である。さらに含水試料の分析が可能であり、大型試料の分析が可能で、試料形状の制約が少ないなど他の方法にない特徴をそなえている。
以上より、XSAMは大気中で含水率の高い試料でも損傷無く簡便に観察が可能であることから生物試料の観察に特に有効であると考えられる。著者らは生体軟組織、特に金属試料を埋入した周囲組織の分析にXSAMを用いており6-8)、本報ではその特徴的な結果について報告する。
図1 X線分析顕微鏡の概略図
【２．軟組織のXSAMによる観察(6)】
本実験では堀場製作所製XSAM（XGT-2000V）では100μｍ及び10μｍ径のXGTを備えており、XGTの径が顕微鏡の分解能を決定する。軟組織のような軽元素主体の試料では十分な蛍光Ｘ線の強度を得るため100μｍのXGTを用いる必要がある。ラット表皮近傍の軟組織を通法に従い固定・パラフィン包埋した試料のXSAMによるCa, S, Pの元素分布像を図２に示す。（本試料は他の動物実験に使用したラットの表皮近傍の一部の提供を受けたものである。）今回のXSAM観察においては10mm四方の領域を3000秒／scanの速度で100回走査を行い、Ca,S,Pの元素分布像を得た。図にはCa, S及びPの明瞭な分布が見られ、特にCaは筋肉部に、Sは筋肉と体毛に、Pは毛根部に高濃度に分布していることが観察された。筋肉中のCaは約0.01wt%、S濃度は0.1〜0.2wt%、P濃度は約0.2wt%と推定され、軟組織のように比較的低濃度の軽元素から成る試料についても明瞭に元素分布を観察できることが示された。濃度が最も低いと推定されるCaで明瞭な分布像が観察され、逆に高濃度のPがやや不鮮明な像となっているが、これは特性Ｘ線のエネルギーが原子番号がS→Caと大きくなるにつれて増大し、試料内部及び大気による吸収が少なくなるためと考えられる。即ちCaでは比較的深部からの特性Ｘ線も比較的吸収されにくいため、試料深部からの信号も併せ検出し、シグナル量が増大するためと考えられる。
図2 ラット表皮近傍組織のXSAMによるCa, S, Pの分布像
【３．金属試料埋入周囲組織のXSAM観察及びEPMAとの比較(7,8)】
Ni小片（1mmφ×10mm）をラット背部皮下に埋入したラット軟組織を通法に従いレジン包埋し、1mm厚に切断してXSAM及びEPMAにより元素分布を観察した。
図3はNi埋入周囲組織のXSAM及びEPMAによる元素分布像を示しており、埋入部近傍にNiが高濃度の領域が見られ、埋入部から離れるに従ってNi濃度が減少している。光学顕微鏡観察ではNi濃度の高い領域では組織の壊死のような強い組織反応が見られ、その外側の領域でも毛細血管の拡張や炎症性細胞の浸潤が観察され、Niの軟組織への影響の強さが示された。このように光学顕微鏡による組織観察と合わせることにより溶出Ni濃度と組織反応の間に関連が見られた。Niは金属材料の中でも発癌性やアレルギーの原因となる可能性が指摘されており(9-11)、本方法によりNiの溶出が可視化され、溶出Ni濃度と組織反応との関連が明らかにされた。
またXSAMとEPMAを比較するとP,
Sのような軽元素ではEPMAの方が分布像が鮮明に見られており、この傾向はPにおいて顕著である。逆にCa,
Niのような中・重元素ではXSAMで鮮明な分布像が確認されている。
図3 Ni埋入試料のXSAM及びEPMAによる元素分布像の比較
この原因としては前述のようにEPMAとXSAMでのX線発生領域の差によると考えられる。EPMAは電子線照射に伴って発生するX線を検出しているが、電子線によって励起される領域の深さは加速電圧に依存するが通常20〜30μｍ程度と考えられる。この程度の深さから発生したX線はほとんど減衰することなく試料表面から脱出し検出されると考えられる。レジン中のX線の平均自由行程を図4に示しているがPの特性X線でも20μｍ程度のレジンを透過することが分かる。従ってEPMAでは軽元素から中・重元素の特性X線もいずれも殆ど減衰せず試料表面から放出されると考えられる。先に生体内での含有量はP>S>Caの順で減少すると述べたが、EPMAのこれらの元素分布像の鮮明度がこの順になっていることからも納得できる。
図4 MMAレジン中での特性X線のエネルギーと吸収係数・平均自由行程の関係
これに対してXSAMでは入射X線は試料を貫通するため、蛍光X線の発生領域は照射域全体と考えられる。左記の図のように原子番号の大きい原子からの特性X線ほどエネルギーが高く平均自由行程も長くなるため、深部からのX線も減衰せずに検出されることとなる。このためP,
Sでは試料表層からのX線のみ検出されるのに対し、本来濃度の低いCaやNiでは試料深部からのX線まで積算・検出するため鮮明な分布像が得られたものと考えられる。さらにXSAMでは測定雰囲気が大気であることも影響する。図5は大気層(1mm)およびXSAMのマイラ膜の吸収について検討した結果であり、軽元素ほど減衰が大きいことが分かる。これも中・重元素の検出に有利に働いた一因と考えられる。
図5 大気層及びマイラ膜のX線透過性
XSAMは大気中で試料を損傷することなく元素分布を観測できるため、特に生物系試料の分析に適しており、特別な試料の処理を要求しないため病理学的組織観察など他の用途に用いた試料を用いることも可能であり、同一試料から多くの知見を得る事が可能である。今後XSAMの更に広範囲への応用が期待される。
【参考文献】
1.小林正義, 渡辺孝一, 宮川修, 新潟歯学会雑誌 26 : 29-37, 1996
2. Nakazawa H, Kanazawa Y, Nozaki H, Hosokawa Y, Wakiyama Y, Komatani
S, Microscopy In biology and medicine (Edited by Shinohara et al),
Japan Sci. Soc. Press, Tokyo/Springer-Verlag, Berlin, 81-86, 1990
3. Furuta K, Nakayama Y, Shoji M, Nakano H, Hosokawa Y, Rev. Sci.
Instrum., 62 : 828-829, 1991
4.Furuta K, Nakayama Y. Shoji M, Kaigawa R, Hanamoto K, Nakano H,
Hosokawa Y, Rev. Sci. Instrum., 64 : 135-142, 1993
5. Hosokawa Y, Ozawa S, Nakazawa H, Nakayama Y, X-ray Spectrom, 26 :
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7. Uo M, Watari F, Yokoyama A, Matsuno H, Kawasaki T, Biomater., 22 :
677-685, 2001
8. Uo M, Watari F, Yokoyama A, Matsuno H, Kawasaki T, Biomater., 22 :
1787-1794, 2001
9. Takamura K, Hayashi K, Ishinishi N, Yamada T, Sugioka Y, J.
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10. Takeshita F, Takata H, Ayukawa Y, Suetsugu T, Biomater., 18 :
21-5, 1997
11. Laing PG, Ferguson AB, Hodge ES, J. Biomed. Mater. Res., 1 :
135-49 ,1967